Las estrategias de estabilización y normalización de la orina favorecen el análisis imparcial del contenido de EV en la orina

Scientific Reports volumen 12, número de artículo: 17663 (2022) Citar este artículo

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La orina presenta una fuente ideal de marcadores de diagnóstico no invasivos. Algunas cuestiones intrínsecas y metodológicas todavía plantean barreras a su máximo potencial como sustrato de biopsia líquida. A diferencia de la sangre, la concentración de orina varía según la nutrición, la hidratación y los factores ambientales. La orina se enriquece con vehículos eléctricos del tracto urinario-genital, mientras que su conservación, purificación y normalización puede introducir sesgos en el análisis de subconjuntos de vehículos eléctricos en comparaciones inter e intraindividuales. El presente estudio evaluó los métodos que disminuyen tales sesgos, como el almacenamiento de orina apropiado y factible, el método óptimo de purificación de EV en un solo paso para la recuperación de proteínas y ARN de pequeños volúmenes de orina y un método de normalización para el análisis cuantitativo de los ARN de EV en orina. Se utilizaron ultracentrifugación, precipitación química e inmunoafinidad para aislar vehículos eléctricos de la orina de donantes sanos que se almacenó congelada o a temperatura ambiente durante hasta 6 meses. Se compararon múltiples parámetros bioquímicos y EV de la orina, incluido el recuento de partículas y el contenido de proteínas, en muestras de orina. Para ello se realizaron análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) y evaluación de proteínas mediante ensayos BCA, ELISA y WB. Estas mediciones se correlacionaron con la abundancia relativa de ARNm y miARN de EV seleccionados evaluados mediante RT-PCR y se clasificaron según su capacidad para reflejar y corregir las variaciones del contenido de EV en muestras de orina longitudinales. Todos los métodos de purificación permitieron la recuperación y el análisis posterior de vehículos eléctricos a partir de tan solo 1 ml de orina. Nuestros hallazgos destacan la estabilidad a largo plazo de los ARN de EV tras el almacenamiento de la orina a temperatura ambiente, así como una excelente correlación del contenido de EV en la orina con algunas características bioquímicas medidas de forma rutinaria, como la proteína y la albúmina total en la orina, pero no la creatinina que se usa más convencionalmente para la normalización de la orina. La evaluación comparativa de ARNm y miARN en aislados de EV reveló ARN específicos, en particular RNY4 y un pequeño panel de miARN, cuyos niveles reflejaban bien la variación de EV entre muestras y, por lo tanto, eran útiles como posibles normalizadores posanalíticos del contenido de ARN de EV. Describimos algunas soluciones realistas de normalización y procesamiento de orina para una lectura imparcial de estudios de biomarcadores de vehículos eléctricos y muestreos y diagnósticos clínicos de rutina que proporcionan información para el diseño de estudios de validación más amplios que emplean vehículos eléctricos en orina como biomarcadores para afecciones y enfermedades particulares.

La orina es una fuente atractiva y susceptible de marcadores de diagnóstico potencialmente valiosos para un conjunto de afecciones clínicas, sobre todo aquellas que afectan el tracto urogenital, como enfermedades o lesiones renales y cánceres urogenitales. Además, los biomarcadores urinarios han demostrado potencial también para patologías no urológicas1,2 como otros cánceres (por ejemplo, cáncer de mama o de pulmón), trastornos metabólicos y endocrinos (por ejemplo, diabetes), afecciones inflamatorias (por ejemplo, aterosclerosis y osteoartritis) e incluso enfermedades neurodegenerativas o neuropsiquiátricas. enfermedades. El uso de análisis de orina para diagnosticar enfermedades es una práctica antigua (por ejemplo, la detección de glucosa en sujetos diabéticos probándola o atrayendo hormigas, o la detección de albúmina como indicador de una enfermedad renal mediante una "prueba de espuma") y sigue siendo un componente subyacente. de la medicina de investigación a lo largo del siglo XX y principios del XXI3. Con el advenimiento de las técnicas ómicas modernas, se revela una gran cantidad de componentes de la orina cuyas alteraciones cuantitativas y cualitativas se espera que tengan valor diagnóstico y predictivo en el ámbito clínico.

Paradójicamente, la orina aún no se ha estudiado como una fuente totalmente no invasiva de biomarcadores de biopsia líquida que pueden usarse longitudinalmente para diagnóstico y seguimiento. Esta paradoja se debe a las características particulares de este biofluido y a los obstáculos metodológicos que aún interfieren con el paso de los candidatos a biomarcadores a la prerrogativa cuantitativa de la validación y la implementación de ensayos de diagnóstico.

A diferencia de la sangre, cuya composición y volumen están estrictamente regulados, la orina no está sometida a mecanismos homeostáticos. La orina es un biofluido único que puede variar en pH, osmolalidad, composición y concentración de solutos dispersos, incluso dentro del mismo individuo y durante horas o días4. La producción de orina en humanos adultos varía dentro de un rango normal de 0,6 a 2,6 l. Estas enormes fluctuaciones inter e intraindividuales en las excreciones de agua y en la concentración de orina que dependen de la dieta, la hidratación, la actividad o factores ambientales, impiden las mediciones objetivas que definen de manera crítica un biomarcador como tal. Es probable que la identificación y evaluación confiables de biomarcadores urinarios se beneficien de plataformas sólidas y específicas que prometan definir mejor el origen (en términos de especificidad tisular o de enfermedad) de los biomarcadores, ya sea en la fase urinaria soluble o sólida. La carta comprende sedimento (normalmente células desprendidas) y vesículas extracelulares (EV).

Los vehículos eléctricos son prometedores como portadores de rasgos celulares específicos, que encapsulan y, por lo tanto, estabilizan especies de biomarcadores poco comunes pero informativas (proteínas, glicanos, ácidos nucleicos, lípidos, metabolitos)5. De tal forma actúan como centinelas en tiempo real de alteraciones tisulares fisiológicas o patológicas. Los primeros avances científicos en la investigación del potencial de los biomarcadores urinarios de EV se han centrado principalmente en los cánceres urogenitales y posteriormente han inspirado la búsqueda de biomarcadores urinarios de EV para otras patologías del tracto urogenital6. De hecho, el primer y único kit de diagnóstico basado en EV de grado comercial, un IntelliScore, desarrollado y lanzado en 2018 por Exosome Diagnostics, se basa en la evaluación de un panel definido de ARNm de EV en muestras de orina. La utilidad de esta prueba para la estratificación de pacientes en cáncer de próstata avanzado versus indolente ha sido ampliamente validada en estudios prospectivos multicéntricos7,8. y hoy el mismo grupo de investigadores está aplicando un concepto similar para el desarrollo y validación de una nueva prueba no invasiva basada en ARN EV urinario para el rechazo de trasplantes9. Sin embargo, para una amplia lista de biomarcadores candidatos a EV urinarios presentados en los últimos años para diferentes patologías, no se ha logrado una validación significativa, y la comparación entre los estudios sigue siendo extremadamente desafiante. Es un consenso de vanguardia6 que algunos aspectos metodológicos de la separación y el análisis de los vehículos eléctricos, incluido el manejo preanalítico y la normalización de los resultados, aún persisten y deben optimizarse y estandarizarse para fomentar la traducción de los hallazgos científicos a la práctica clínica.

Si bien los vehículos eléctricos están presentes de manera ubicua en la orina, su concentración es baja en relación con las proteínas secretadas más abundantes, como la uromodulina. De hecho, se ha descubierto que la uromodulina es la proteína más abundante que contamina las preparaciones de AE ​​en los estudios proteómicos. El grado de contaminación dependió de las muestras probandos y del método de purificación de EV utilizado. Aunque se considera un desafío técnico en la eficiencia de la extracción de EV en orina, la contaminación con uromodulina no mostró la reducción obvia en las bandas de otras proteínas EV abundantes en la proteómica de escopeta y no interfirió con el análisis de la carga de ARN urinario de EV10.

El contenido de VE en la orina es potencialmente aportado por diferentes tejidos, con el enriquecimiento esperado con vesículas liberadas desde distintos segmentos de la ruta urogenital6. Investigaciones recientes han indicado que la heterogeneidad de los vehículos eléctricos es incluso más pronunciada de lo previsto anteriormente, con análisis bioinformáticos de datos ómicos que muestran una amplia representación de moléculas en los vehículos eléctricos urinarios de todo el cuerpo, sin que se espere un gran sesgo hacia las proteínas renales o urinarias10. Se han descrito diferentes protocolos de aislamiento para el análisis proteómico y transcriptómico de EV urinarios, que probablemente aíslen diferentes subpoblaciones de vesículas o al menos permitan diferentes rendimientos y purezas, cada uno de los cuales puede ser apropiado para diferentes cuestiones clínicas4,11. Nos hemos centrado en los métodos que permiten el aislamiento de vehículos eléctricos en un solo paso y que son adecuados para volúmenes escalables, lo que permite el procesamiento y análisis de muestras de orina recolectadas de forma rutinaria y de biobancos. La conservación y el procesamiento de muestras afectan la detección de los analitos contenidos en la orina, incluidos los subconjuntos de EV, y el enfoque de normalización puede introducir sesgos en las comparaciones inter e intraindividuales/poblacionales. Hemos abordado los métodos de almacenamiento que son aplicables en la práctica clínica habitual así como facilitar la logística del intercambio de muestras en estudios multicéntricos. Hasta la fecha se han propuesto varios métodos para la normalización del descubrimiento de biomarcadores urinarios, incluida la normalización del tiempo, la normalización de la creatinina o la proteína12,13,14,15. Como los vehículos eléctricos se ven afectados por las enormes fluctuaciones de concentración típicas de todos los componentes de la orina, se propuso y a menudo se adoptó la aplicabilidad de métodos similares a los biomarcadores de vehículos eléctricos sin la evaluación comparativa de diferentes métodos o la correlación con los parámetros independientes de vehículos eléctricos dentro del mismo estudio. La normalización del tiempo, en particular la recolección de orina acumulada a 24 h, es difícil de implementar y descartaría muestras de biobancos que normalmente contienen orina puntual. Desde un punto de vista práctico, se prefiere la orina puntual (aleatoria) o, alternativamente, la primera o segunda orina de la mañana, tal como se recoge habitualmente durante las consultas clínicas. La creatinina se utiliza con mayor frecuencia para calibrar las mediciones de orina también en los estudios que involucran EV urinarios16, pero sus variaciones no son completamente atribuibles simplemente a variaciones en la concentración de orina. Por esta razón, la normalización de la creatinina puede enmascarar variaciones cuantitativas correlacionadas con la enfermedad y fallar en las comparaciones entre poblaciones o incluso en el seguimiento longitudinal. Se necesita un método de normalización más común y confiable adecuado para el despliegue de marcadores de vehículos eléctricos.

En este estudio, primero abordamos las condiciones para el almacenamiento y envío de orina, así como la viabilidad del método de purificación apropiado para volúmenes bajos (típico de muestras de biobancos) que garantice una recuperación confiable y cantidades suficientes de marcadores EV. En la segunda parte del estudio, investigamos el método de normalización que incluye recuentos de EV y medición de creatinina/proteína que hasta la fecha se utilizan comúnmente en estudios informados sobre EV urinarios, y los comparamos con indicadores bioquímicos en orina y valores absolutos y relativos de EV específicos. marcadores. Aunque describimos un estudio piloto basado en un pequeño conjunto de muestras de orina probando, nos sirvió para establecer la correlación y clasificación de diferentes parámetros de orina y EV que pueden abordarse en estudios de validación más amplios, realizados en cohortes independientes y en combinación con los biomarcadores de condición específicos. La especificación y la integración de estos requisitos fundamentales contribuirán en última instancia a una hoja de ruta para la validación e implementación de biomarcadores EV en orina.

En la primera parte del estudio, realizamos una comparación metodológica, que abarcó 2 temperaturas de almacenamiento (-80 °C y RT), en 2 momentos (mes y 6 meses) y 3 métodos utilizados para la extracción de EV de orina (ultracentrifugación diferencial (UC ), pull-down basado en inmunoafinidad (IP) o precipitación química (CP). Utilizamos 3 donantes probandos (donantes sanos, caucásicos, hombres, 35 a 45 años). Para disminuir el impacto de errores operativos aleatorios a un Para un tamaño de muestra pequeño, hemos procesado de forma independiente dos alícuotas para cada muestra de orina, de tal manera que pudimos (1) evaluar la desviación estándar entre réplicas técnicas y (2) evaluar réplicas biológicas adicionales para cada muestra y ensayo utilizado. La evaluación de la creatinina tampoco se realizó en orina pura (antes de la purificación de EV). Todas estas variables se combinaron en un diseño integral que también incluyó pruebas paralelas de varios parámetros biofísicos y bioquímicos de EV urinarios medidos de forma independiente. De tal manera, aunque a partir de solo 3 donantes probandos, teníamos un número constante de puntos experimentales para analizar (ruta 1A en el esquema a continuación).

En la segunda parte del estudio, abordamos la cuestión de las variaciones inter e intra (día a día) de las muestras en el contenido de EV, cuando no esperaríamos que el estado fisiopatológico de nuestros probandos sanos hubiera cambiado drásticamente. Se partió de 2 muestras probandos, donantes sanos, 1 mujer (caucásico, 45 años) y 1 hombre (caucásico, 43 años), de cada una se han recogido tres muestras longitudinales. Para cada muestra recolectada, la UC procesó de forma independiente 2 alícuotas de orina como un protocolo que nos permitió evaluar y comparar una gran cantidad de parámetros EV, como se describe (ruta 1B en el esquema a continuación). La orina pura se ha utilizado para NTA, BCA y análisis de orina bioquímicos completos.

Representación esquemática del flujo de trabajo realizado en el estudio.

La primera orina de la mañana se recogió de voluntarios sanos (caucásicos, de 43 a 45 años, ver detalles en "Diseño del estudio") en un recipiente con tapa de rosca estéril, se mantuvo dentro de 1 hora a temperatura ambiente hasta su procesamiento (parte B del estudio) o almacenamiento. (parte A). Antes de su posterior procesamiento o almacenamiento, la orina se centrifugó a 300 g, a temperatura ambiente durante 15 minutos (Eppendorf, Centrifuge 5804 R) para eliminar un precipitado grueso (células y desechos). La orina se almacena durante 1 o 6 meses a -80 °C o se complementa con conservante de orina (Norgen Biotek Corp.) según las recomendaciones del fabricante. En caso de congelación, las muestras de orina se congelan primero a -20 °C y poco después se colocan a -80 °C. Esto cumple con la capacidad de la práctica hospitalaria de recolección de orina. Una vez descongelado, se calentó a 37 °C y se centrifugó nuevamente a 300 g, antes del análisis y/o purificación del EV. La orina pura (antes del aislamiento del EV) se utilizó para el análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA), la evaluación del contenido de proteínas (BCA) y ELISA, así como para el análisis bioquímico integral de orina realizado en el laboratorio de análisis clínicos del Hospital San Raffaele.

Después de 1 o 6 meses de almacenamiento y, en el caso de muestras congeladas (descongelación rápida y calentamiento breve hasta 37 °C), primero hemos aclarado previamente la orina mediante centrifugación a 300 × g para eliminar el sedimento y posteriormente centrifugamos la muestra a 12 000 × g. para retirar el pellet MV. Luego, el sobrenadante se sometió a 3 protocolos de purificación de exosomas que emplean ultracentrifugación (UC), precipitación química (CP) y extracción mediada por inmunoperlas (IP). El volumen de orina inicial fue de 4 ml para UC y 1 ml para IP y CP, mientras que para la comparación posterior del protocolo se consideró la cantidad de muestra correspondiente a 1 ml de orina original. Para cada muestra de orina, se procesaron dos alícuotas de forma independiente con cada método de purificación para evaluar la solidez de los métodos utilizados (ver "Diseño del estudio"). El calentamiento de la muestra antes del aclaramiento previo de la muestra hizo que la orina se volviera transparente y mantuvo abundantes componentes de la orina, como la uromodulina, en solución, evitando así la pérdida de EV debido a un atrapamiento en grandes complejos proteicos similares a geles durante los pasos de centrifugación baja. También hemos confirmado un valor de pH normal a ligeramente alcalino de las muestras de orina utilizadas (7,5 a 8) mediante mediciones con papel tornasol1. Preferimos este procedimiento a otros pasos que alteran la solubilidad de la uromodulina, como la DTT o el tratamiento con detergente3,4. El protocolo de ultracentrifugación se ajustó a partir de Cheng et al.17. Brevemente, la orina se sometió a pasos de centrifugación secuenciales, que comprendían la centrifugación a baja velocidad de 15.000 g durante 10 minutos para la recolección de microvesículas (MV) y los pasos posteriores de ultracentrifugación y lavado a 110.000 g (Beckman Coulter, Optima L-90K Ultracentrifuge, ángulo fijo). rotor) durante 2 h. Todos los pasos de centrifugación se realizan a temperatura ambiente (22 °C). El lavado se realiza en 1xPBS (Gibco) libre de partículas y no se aplicaron pasos de filtrado adicionales para excluir o seleccionar aún más los vehículos eléctricos por tamaño. La recuperación de EV mediante protocolo IP se basó en el uso de perlas de látex NH2 disponibles comercialmente (400 nm) (HansaBioMed Life Sciences, Tallin, Estonia) recubiertas con anticuerpos anti-CD9, siguiendo las instrucciones del fabricante y los protocolos publicados previamente18. Las muestras se incubaron con 10 µl de perlas a 4 °C en un rotador. Tras la unión de EV, las perlas se recuperaron mediante centrifugación en mesa superior (5000 x g durante 10 min) y se lavaron tres veces con PBS 0,05% Tween-20 (PBST). Para el aislamiento de EV mediante CP, las muestras se trataron con el reactivo de precipitación Exo-Prep (HansaBioMed OU, Tallin, Estonia), según las instrucciones del fabricante. Brevemente, tras la adición del reactivo Exo-Prep (relación de volumen 1:4), las muestras se incubaron durante 1 h en hielo. El sedimento de exosoma se recuperó mediante centrifugación en banco a 7000 x g, durante 10 minutos, y se lavó tres veces en PBS.

El análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) se realizó utilizando un microscopio NanoSight LM10-HS (NanoSight, Ltd.) equipado con un láser de 405 nm utilizando el software NTA v3.00 integrado. Las muestras se diluyeron con PBS para alcanzar una concentración de trabajo de 20 a 120 nanopartículas por cuadro y/o 107 a 109 nanopartículas/ml. Para cada muestra, se grabaron tres vídeos de 30 segundos con una velocidad de fotogramas de 30 fotogramas por segundo. La temperatura fue monitoreada y registrada durante todas las mediciones. Los vídeos capturados se analizaron mediante el software NTA (versión 3.2) (Malvern Panalytical) para determinar la concentración y el tamaño de las nanopartículas con un error estándar relativo. Para el análisis, se utilizaron configuraciones automáticas para el desenfoque, la longitud mínima de la pista y el tamaño mínimo de partícula esperado. Antes del análisis, la calibración del sistema NanoSight se realizó utilizando microperlas de látex de poliestireno con un tamaño de 100, 200 nm y 400 nm (NanoSight, Ltd.).

Las mediciones de la concentración de proteínas en todas las muestras analizadas se realizaron utilizando el ensayo de proteínas Pierce™ BCA (Thermo Fisher Scientific), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

El ensayo ELISA tipo sándwich basado en EV (ExoTEST™; HansaBiomed Life Sciences) se realizó en microplacas de 96 pocillos, según el protocolo del fabricante. Brevemente, se incubaron microplacas recubiertas con anticuerpos de captura primaria anti-CD9 y anti-CD63 con estándares y muestras durante la noche a 4 °C. Los pocillos de la microplaca se trataron con anticuerpos de detección primaria anti-CD9-bio, seguido de una incubación con anticuerpos secundarios conjugados con HRP-estreptavidina y solución de sustrato TMB. Se añadió solución de parada (H2SO4 2 N) a cada pocillo de la microplaca. El ensayo se calibró utilizando una curva estándar preparada con diluciones lineales de exosomas purificados de orina humana (HBM-PEU; HansaBioMed Life Sciences) incluidas en el kit ELISA como estándares. Las densidades ópticas se determinaron utilizando un lector de microplacas Infinite-M1000 (TECAN) ajustado a 450 nm.

El contenido de proteína EV se determinó mediante el ensayo del ácido bicinconínico. Se resuspendió una cantidad igual de proteínas en tampón de muestra Laemmly y se separaron mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras para la detección de CD9 y CD63 o en condiciones reductoras para la detección de Alix y TSG101. Las proteínas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa, se incubaron con leche en polvo descremada al 5% en TBS-T (Tween-20 al 0,5%) durante 1 h y luego con los siguientes anticuerpos: anti-CD9 (1:1000, HansaBiomed Life Sciences) , anti-CD63 (1:20.000, BD Pharmingen), anti-TSG101 (1:1000, Abcam, Ab83, 4A10), anti-GAPDH (1:1000, Santa Cruz Biotechnology). Se utilizaron anticuerpos secundarios conjugados con HRP (anti-IgG de ratón/conejo, anticuerpo completo unido a HRP de burro, GE Healthcare) y las bandas inmunorreactivas se visualizaron utilizando la quimioluminiscencia mejorada (ECL) (Merck Millipore). La intensidad de la señal en la transferencia se analizó y cuantificó adicionalmente mediante análisis densitométrico utilizando el software ImageJ (ImageJ incluido con Java 1.8.0_172 de 64 bits descargado de https://imagej.nih.gov/ij/).

Se aisló ARN asociado a EV de cada sedimento de EV purificado utilizando un kit de aislamiento de ARN, según el protocolo del fabricante (HansaBiomed Life Sciences). La concentración de ARN era demasiado baja para medirse de forma fiable mediante medición fluorométrica (ensayo Qubit RNA HS, Thermo Fisher). Para evaluar la expresión de los ARN asociados a EV, se realizó una PCR en tiempo real por triplicado utilizando el kit miScript II RT Qiagen para la generación de ADNc, que se utilizó posteriormente como plantilla para ensayos de PCR con tecnología SYBR Green que emplea ensayos de cebador QuantiTect (Qiagen) para β-actina. y ARNm de PSA. Para la amplificación de ENY4 se utilizaron las siguientes secuencias de pares de cebadores directos e inversos (5'-3'): GTCCGATGGTAGTGGGTTA y AAAGCCAGTAAATTTAGC. Para evaluar la expresión de miARN, utilizamos ensayos de cebadores miScript (Qiagen) para miARN individuales de interés o el juego de tarjetas TaqMan® Array Human Micro-RNA A + B más cebadores megaplex Pre-Amp (Thermo Fisher) para la identificación de firmas de miARN. Todas las reacciones de PCR se realizaron en el sistema de detección de PCR en tiempo real CFX96TM (Bio-Rad, Hercules, CA, EE. UU.) utilizando microplacas de reacción de 96 pocillos (Bio-Rad, Hercules, CA, EE. UU.) y se analizaron mediante CFX Manager SoftwareTM para calcular ciclos umbral (Ct). Para apreciar las variaciones en la expresión de ARN, los resultados se expresan (1) utilizando un método de Ct comparativo. En particular, los valores de Ct se convierten en cantidades en una escala lineal (asumiendo una eficiencia de amplificación del 100% para cada ARNm, (2(40-Ct)); o (2) usando el método ΔCt y/o ΔΔCt, con ARN extraído de Los vehículos eléctricos aislados de cultivos de células LnCAP de cáncer de próstata se utilizaron como muestra de referencia. Estas muestras de vehículos eléctricos de referencia están actualmente disponibles en HansaBiomed Life Sciences.

El análisis estadístico se realizó utilizando software disponible en línea para análisis de datos (www.icalcu.com). Brevemente, aplicamos la prueba ANOVA de un par para comparaciones de grupos cuando correspondía, seguida de la prueba post-hoc de Tukey o Bonferoni. Los detalles se proporcionan en las leyendas de cada cifra de datos.

El estudio se realizó de acuerdo con las directrices de la Declaración de Helsinki y fue aprobado por el Comité de Ética Institucional del hospital San Raffaele (código de protocolo URINEBIOMAR, fecha de aprobación 08/04/2016). Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los sujetos involucrados en el estudio.

La principal fuente de variabilidad en el descubrimiento y validación de biomarcadores son las decisiones preanalíticas con respecto a la recolección, el almacenamiento y el procesamiento de muestras. Los protocolos de consenso actuales para los vehículos eléctricos en orina favorecen el almacenamiento a -80 °C, aunque la congelación y descongelación pueden causar algunas pérdidas o artefactos de vehículos eléctricos, como agregación de vehículos eléctricos o pérdida selectiva de vehículos eléctricos (VM) más grandes2. En este estudio hemos probado el uso de un conservante disponible comercialmente que afirma la conservación del ARN/microARN/ADN y las proteínas en orina durante más de 2 años a temperatura ambiente (RT). Nos hemos centrado en pequeñas vesículas de tamaño nanométrico (nsEV) que, según se informa, son notablemente resistentes a los ciclos de congelación-descongelación19,20. Es probable que estén enriquecidos con exosomas, aunque posiblemente contengan una fracción de vesículas que no se originan en cuerpos multivesiculares. La evaluación de la estabilidad se realizó en muestras de 3 donantes sanos, con 2 alícuotas de muestra procesadas de forma independiente de cada donante, con un total de 6 réplicas biológicas.

Para comparar la estabilidad de la concentración de partículas similares a exosomas y el contenido general de proteínas, hemos medido el número de partículas mediante análisis NTA en orina previamente aclarada y en MV reconstituido y gránulos de exosomas de muestras de UC y CP. También procesamos las mismas muestras con un protocolo IP basado en inmunoperlas (como se explica en "Diseño del estudio" en la sección "Material y métodos"), pero los vehículos eléctricos unidos a perlas no permiten métodos analíticos como NTA o medición del contenido de proteínas. Es por eso que en los experimentos representados en las Figs. 1 y 2 solo se compararon UC y CP, mientras que los tres métodos se utilizaron para la extracción y cuantificación de miARN EV (Fig. 3). Como era de esperar de nuestra experiencia anterior, la UC generó importantes rendimientos de los vehículos eléctricos. También pudimos apreciar una detección significativa de partículas del tamaño de un exosoma (tamaño medio de alrededor de 100 nm) en fracciones de MV reconstituidas, lo que confirma la co-granulación observada anteriormente de EV también de tamaño nanométrico con vesículas más grandes a velocidades de centrifugación más bajas. En las muestras analizadas después de 6 meses, la concentración y el tamaño general de EV no parecen afectados significativamente por el almacenamiento, aunque la cantidad de vesículas recuperadas es un poco menor tras la exposición a temperatura ambiente (RT) (Fig. 1A). Por el contrario, en muestras de un mes de edad, la concentración de EV se mantiene mejor a temperatura ambiente con respecto a las muestras congeladas (Fig. 1B).

Recuento y dimensionamiento de vesículas extracelulares (VE) aisladas de orina conservada en diferentes condiciones. Los vehículos eléctricos se purificaron a partir de orina obtenida de tres voluntarios sanos mediante ultracentrifugación diferencial (UC) y precipitación química (CP) y se conservaron a -80 °C (F) o se adyuvaron con el conservante a temperatura ambiente (P). Se incluyeron microvesículas (MV) en el análisis. En la evaluación se incluyen muestras de tres donantes sanos y 2 alícuotas procesadas de forma independiente de cada donante. El análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) muestra la concentración y el tamaño de las partículas como media + DE después de 6 meses (A) y 1 mes (B) de almacenamiento. El análisis de los datos se realiza mediante una prueba no paramétrica para la comparación de múltiples grupos, a saber, ANOVA de 1 VÍA seguida de la prueba post-hoc de Tukey, no se observaron diferencias significativas (valores de p <0,05).

Análisis cuantitativo del contenido de proteínas de los vehículos eléctricos. Los vehículos eléctricos se purificaron a partir de orina obtenida de tres voluntarios sanos y se procesaron de forma independiente dos alícuotas de cada donante. Las orinas se congelaron a –80 °C (F) o se adyuvaron con el conservante y se almacenaron a temperatura ambiente (P). Después de 1 y 6 meses de almacenamiento de la muestra, el aislamiento de EV se realizó mediante ultracentrifugación diferencial (UC) y precipitación química. (CP). La Figura muestra el contenido de proteína total medido mediante el ensayo BCA y el contenido de creatinina determinado en orina entera y en microvesículas de orina (MV) y aislados de EV de un único donante representativo (A). Para las mismas muestras de donantes, el contenido específico de proteínas EV canónicas se abordó mediante Western Blot (C, a saber, CD63, CD9, Tsg101 y Alix) (C) La expresión de CD63 y CD9 también se midió para todas las muestras analizadas mediante un ensayo ELISA (BEV preparados del medio acondicionado con células LNCaP se utilizaron como estándares para comparaciones relativas en el ensayo ELISA. Se utilizó una prueba no paramétrica para la comparación de múltiples grupos (tres réplicas cada uno) ANOVA de 1 VÍA seguida de una prueba post-hoc de Tukey para el análisis de los datos de ELISA; Todos los valores de p < 0,05 están marcados con *, < 0,01 con **, < 0,001 con ***.

Cuantificación del contenido de miARN EV. El ARN total se extrae de vehículos eléctricos purificados a partir de muestras de orina obtenidas de donantes sanos (N = 3), almacenados ya sea conservados a temperatura ambiente (P) o congelados (F), mediante protocolo basado en ultracentrifugación (UC), precipitación química (CP) o inmunoterapia. -precipitación con perlas recubiertas de anti-CD9 (IP). La amplificación por RT-qPCR se realiza de los miARN que se describe que están contenidos en los vehículos eléctricos, a saber, miR-16, miR-21, miR-210 y miR.451. Mostramos la expresión relativa promedio de miARN de tres réplicas biológicas. La expresión relativa se calculó con respecto a una muestra de referencia con entrada de ARN constante y conocida (ARN EV del cultivo celular LnCAP). En la evaluación se incluyen muestras de tres donantes sanos y 2 alícuotas procesadas de forma independiente de cada donante. Se utilizaron ANOVA unidireccional y la prueba post-hoc de Bonferroni para determinar la significación estadística de las diferencias observadas * indica valor de p < 0,05, ** valor de p < 0,01 y *** valor de p < 0,001.

Las mediciones de NTA estuvieron bastante en línea con la determinación del contenido general de proteínas (Fig. 2A). Después de 6 meses, el pellet UC tuvo valores más altos en muestras congeladas (aumento de 2,8 veces) con la tendencia que fue la misma pero más pronunciada con respecto a las mismas muestras medidas en NTA (1,3 veces). El contenido total de proteína en la orina no pareció verse afectado por las diferentes condiciones de almacenamiento, mientras que se midieron niveles más altos de creatinina en muestras congeladas con respecto a las muestras RT (1,6 veces). En cambio, después de un almacenamiento a corto plazo, el contenido de proteína del sedimento de UC del exosoma fue significativamente mayor en las muestras almacenadas a temperatura ambiente (1,5 veces), mientras que los niveles de creatinina en orina tuvieron una deriva opuesta y cayeron 1,8 veces con respecto a las muestras congeladas. Las variaciones de creatinina no resultaron significativas, pero la tendencia opuesta observada para la creatinina con respecto al contenido de proteína EV generó dudas sobre la idoneidad de la creatinina como calibrador del contenido de proteína EV en la orina. Por lo tanto, esta cuestión se abordó más detalladamente en la segunda parte de este estudio. Los datos observados sobre la conservación de las proteínas EV respaldan en general el uso del almacenamiento RT de muestras de orina, especialmente durante un almacenamiento de 1 mes.

Además, hemos evaluado la cantidad de EV reconocidos y marcadores de exosomas mediante ensayos cuantitativos comunes como ELISA y Western Blot. El ensayo ELISA tipo sándwich que mide el nivel de vesículas pequeñas que (co)expresan CD9 y CD63 mostró correlación con el contenido general de proteínas y la medición del número de vesículas (Fig. 2B y Fig. 1 complementaria). CD9 y CD63 son tetraspaninas enriquecidas en exosomas que se sabe que se expresan bien en las vesículas urinarias4,6,10,21. Las señales fueron mayores (más de tres veces) en las muestras conservadas congeladas durante 6 meses, mientras que, a la inversa, más prominentes (~ dos veces) en aquellas muestras almacenadas durante 1 mes a temperatura ambiente. El análisis de transferencia Western del sedimento de UC de las mismas muestras mostró datos concordantes con respecto al contenido de proteínas exosomales genuinas Alix y Tsg101 (Fig. 2C). La tendencia opuesta para las tetraspaninas CD9 y CD63 revelada por WB en muestras conservadas a largo plazo (6 meses) plantea la posibilidad de contaminación de los gránulos con fragmentos de membrana y estaría en línea con la integridad comprometida de las vesículas y las proteínas expuestas en la superficie tras el almacenamiento a largo plazo a temperatura ambiente. .

El contenido de ARN de EV es uno de los indicadores fundamentales de la integridad y funcionalidad de las vesículas, siendo los ARN tanto biomarcadores putativos como efectores en las funciones pleiotrópicas ejercidas por las vesículas en la salud y la enfermedad3,7,9. Hemos evaluado la estabilidad del contenido general de ARN de vesículas sedimentadas a partir de muestras de orina almacenadas de manera diferencial, con especial atención en una categoría de ARN más abundante que se encuentra en los vehículos eléctricos, los pequeños ncRNA. Hemos intentado utilizar el fluorímetro Qubit 2.0 (kit Qubit Small RNA) además de las estimaciones de concentración del bioanalizador para cuantificar los niveles de ARN total en muestras de orina EV. Los perfiles de ARN del bioanalizador coincidieron con > 80 % de abundancia de ARN pequeños (miARN) en todas las muestras, pero el contenido de ARN resultó demasiado bajo para permitir mediciones precisas de Qubit 2.0, y algunas muestras contenían < 250 pg/μl. Esto último era de esperar ya que nuestras muestras se obtuvieron de volúmenes de orina tan bajos como 1 ml11. Por lo tanto, no pudimos usar una cantidad fija de ARN, pero decidimos usar un volumen de orina original igual para la normalización de la entrada y las reacciones de amplificación. Tal decisión está en línea con la práctica común en el muestreo diagnóstico22. Los miARN se encuentran entre las moléculas de carga de exosomas que han despertado un interés sustancial y se han abordado desde el principio por su potencial interés clínico. Se han descrito diferentes miARN asociados a vesículas urinarias en sujetos sanos o enfermos6,12,23,24,25. Para realizar pruebas de estabilidad en este estudio, primero seleccionamos varios miARN comúnmente expresados ​​en vehículos eléctricos, también en orina23,25. Al cabo de 1 mes de almacenamiento, miARN notoriamente abundantes, como miR-21, 16 y 210, se amplifican con éxito (con valores de Ct que oscilan entre 23 y 33) a partir de vesículas del tamaño de un exosoma purificadas a partir de 1 ml de orina y mostraron una alta estabilidad en muestras conservadas en RT (Figura 3). El contenido de los miARN analizados se cuantificó como expresión relativa a la de una muestra de referencia con una entrada de ARN conocida y constante (ARN EV del cultivo celular LnCAP)13,14. Como se esperaba, miR-451 resultó poco abundante, pero aún así se reveló en todas las muestras analizadas. También se confirmó una mayor estabilidad de los ARN de EV tras el almacenamiento a temperatura ambiente después de 6 meses, en particular en muestras de UC. Los tres métodos empleados proporcionaron material que se puede amplificar y cuantificar de manera confiable, con la expresión de miARN más baja obtenida de muestras de IP. Este resultado ha sido anticipado por un hecho reconocido de que la inmunoafinidad selecciona subpoblaciones de EV, compensando el rendimiento por la especificidad y la pureza. Se observa una excepción interesante para el miARN 210 que resultó altamente enriquecido en muestras de IP (Fig. 3).

Se observó cierta incoherencia en el rendimiento y la estabilidad entre diferentes especies de ARN en los diferentes protocolos de aislamiento utilizados. Los niveles de miR-21 y 16 estaban más en línea con los parámetros de vesículas medidos de forma independiente (recuento de vesículas mediante NTA o cuantificación de proteínas). La posible pérdida selectiva de algunas especies y algunos subconjuntos de vesículas puede depender del protocolo de aislamiento, como se informó anteriormente3,15. Es de destacar que la ventaja de la conservación por RT sobre la congelación de la orina fue particularmente evidente para la recuperación de ARNm después de 6 meses de almacenamiento (Fig. 4), así como para la recuperación del contenido de ARN de MV. En este estudio, hemos evaluado dos ARN ampliamente informados en vehículos eléctricos de biofluidos (beta-actina) y en vehículos eléctricos urinarios (PSA). Las muestras utilizadas para estos experimentos procedían de donantes masculinos y el ARNm del PSA presenta características como indicador de vesículas derivadas de la próstata. En general, podemos observar que la conservación de la orina a temperatura ambiente para análisis posteriores del ARN del EV es una buena opción después del almacenamiento a corto y largo plazo. Si bien el almacenamiento a temperatura ambiente a largo plazo no es una estrategia viable para el análisis de proteínas, implementarlo en un período de tiempo corto (dentro de un mes) podría ser una solución excelente que favorezca la estabilidad, el fácil manejo y el envío de muestras de orina para un análisis completo de EV. Una indicación secundaria del primer conjunto de datos que justifica un estudio más profundo es que tanto el método de almacenamiento como el de aislamiento podrían introducir un sesgo en la pérdida o recuperación de distintas poblaciones de vehículos eléctricos en la orina.

Cuantificación del contenido de ARN/miARN de EV y MV. El ARN total se extrae de los gránulos de MV y de los EV purificados a partir de muestras de orina obtenidas de donantes sanos (N = 3), almacenados en conserva a temperatura ambiente (P) o congelados (F), mediante un protocolo basado en ultracentrifugación (UC). precipitación química (CP) o inmunoprecipitación con perlas recubiertas de anti-CD9 (IP). La amplificación por RT-qPCR de los ARNm que antes se describía que estaban contenidos en los vehículos eléctricos en orina, es decir, la β-actina y el ARN RNY, se realizó como se describe en Material y métodos. Tanto estos ARNm como miARN (miR-16, miR-21, miR-210 y miR.451) se analizaron también en MV. En la evaluación se incluyen muestras de tres donantes sanos y 2 alícuotas procesadas de forma independiente de cada donante. Se utilizaron ANOVA unidireccional y la prueba post-hoc de Bonferroni para determinar la significación estadística de las diferencias observadas * indica valor de p < 0,05, ** valor de p < 0,01 y *** valor de p < 0,001.

En la segunda parte del estudio, hemos abordado varias opciones de normalización que permitirían la cuantificación e interpretación de las diferencias en las abundancias de ARN y proteínas exosomas/EV en el contexto de la variabilidad intrínseca de la concentración de orina y EV en orina. Para tomar la mejor decisión que se ajuste a nuestro alcance de proponer el método viable tanto para la investigación como para la práctica clínica, hemos considerado las siguientes premisas. Aunque para comparaciones cuantitativas podría ser deseable una recolección de orina de 24 horas, la recolección de la primera orina de la mañana es definitivamente un procedimiento más práctico y convencional que garantiza un mayor cumplimiento por parte del paciente. Además, los estudios sobre proteinuria han demostrado que este método de recolección aleatoria de muestras de orina es válido y que la tasa de excreción de proteínas se correlaciona bien con la encontrada en la orina de 24 h16. Otra opción preanalítica frecuente en el diagnóstico común es que el volumen de las muestras esté normalizado. En el caso de análisis de sangre, debido a un estricto control homeostático, probar y comparar los mismos volúmenes de muestras es una opción estándar. En la orina, este enfoque conduce a inconsistencias en la cuantificación de los marcadores EV. Primero evaluamos la concentración de exosomas y el contenido de marcadores vesiculares reconocidos en muestras longitudinales con el objetivo de identificar los parámetros EV confiables y mensurables que pueden usarse para la normalización. Para ello se ha utilizado un pequeño número de muestras probandos de 2 donantes sanos, un hombre (caucásico, 43 años) y una mujer (caucásico, 45 años), de los que se han recogido muestras de orina en 3 días consecutivos. Cada muestra se dividió en dos alícuotas que se procesaron de forma independiente, aumentando así el número de réplicas biológicas y disminuyendo el impacto de un error operativo aleatorio a un tamaño de muestra pequeño.

Primero, medimos la concentración de partículas del tamaño de un exosoma y el contenido de proteínas tanto en muestras de orina pura como en aislados de EV preparados mediante ultracentrifugación. Se seleccionó este método de aislamiento porque sigue siendo el método principal utilizado en los estudios de EV urinarios y ha proporcionado el mejor rendimiento entre los métodos de purificación presentados en este estudio. Además, conceptualmente, la UC no debería introducir un sesgo frente a subpoblaciones de vehículos eléctricos específicos, excepto para favorecer la recuperación de vehículos eléctricos pequeños, mientras que los aislados de vehículos eléctricos obtenidos pueden analizarse mediante diferentes métodos, incluidos NTA, ELISA y Western Blot. Las mediciones de NTA revelaron fluctuaciones significativas en el número general de EV dentro y entre dos donantes sanos (Fig. 5A). Sorprendentemente, no hubo correlación entre los recuentos de EV en la orina completa y en los gránulos de UC purificados, mientras que se observó una buena concordancia entre el contenido de proteínas de la orina completa y el de las fracciones de exosomas (UC) extraídas (Fig. 5A, B y Fig. 1 complementaria). El análisis de los marcadores EV canónicos mediante Western Blot confirma las variaciones diarias en el contenido de proteína EV medido en el volumen de orina constante (Fig. 5C). La expresión de los marcadores exosomales auténticos Tsg101 y Alix aparentemente se correlacionaba mal con el contenido total de proteínas o el recuento de vesículas y tenía un patrón diferente al de las tetraspaninas CD9 y CD63. Para evaluar mejor los patrones de proteínas individuales, hemos realizado un análisis densitométrico de bandas de gel (ImageJ, Fig. 5C) que destacó que la señal de CD9 refleja mejor otros parámetros cuantitativos independientes de los gránulos de EV (número y contenido total de proteínas de las vesículas). Cabe destacar que CD9, según densitometría, tiene una excelente correlación con el patrón Tsg101 pero no con el patrón Alix. Aunque CD9 no se limita exclusivamente a los exosomas, sino que también se expresa abundantemente en MV (no se muestra aquí), se sabe que está altamente enriquecido en vesículas del tamaño de un exosoma con respecto tanto a las células madre como a otras subfamilias de vesículas. El atractivo de CD9 reside en el hecho de que se muestra en la superficie de las vesículas y, por lo tanto, puede explotarse para estrategias de aislamiento y, lo que es de destacar para el objetivo de este estudio, para la cuantificación rápida de vesículas. Como se muestra en la figura complementaria 1, la correlación entre el contenido de proteína EV y la concentración de partículas medida en vehículos eléctricos pequeños aislados es justa pero no perfecta (R = 0,781), mientras que el contenido de proteína EV se correlaciona mejor con los recuentos de partículas en el original puro. orina (R = 0,817). De manera similar, también el contenido de CD9 se alineó mejor con el número de partículas medido en la orina pura original (R = 0,860) que en los gránulos de EV (R = 0,607), mientras que se correlacionó muy bien con el contenido de proteínas de los EV aislados (r = 0,931). . En general, entre todos los indicadores independientes del contenido de EV en la orina, encontramos el mejor patrón de coincidencia entre el contenido de proteínas de los gránulos de EV aislados, incluida la medición de CD9, y el recuento general de partículas similares a exosomas (VE pequeños) en la orina pura original. mantenga estos dos como parámetros relacionados con los vehículos eléctricos más atractivos para reflejar su contenido general.

Análisis comparativo del contenido de VE en muestras de orina longitudinales. Los EV (UC) y MV se purificaron mediante un protocolo basado en (ultra)centrifugación diferencial a partir de orina obtenida de dos voluntarios sanos, una mujer (marcada como 1) y un hombre (marcado como 2), de 45 y 43 años, en 3 estudios posteriores. días. Para cada muestra se procesaron dos alícuotas de orina de forma independiente y los resultados se presentaron como promedios + DE. El contenido total de proteínas se midió en orina completa, MV y EV mediante el ensayo BCA (A), la concentración de partículas determinada mediante la medición de NTA (B) y las proteínas EV evaluadas mediante Western Blot (C). La intensidad de la señal en la transferencia se analizó y cuantificó adicionalmente mediante análisis densitométrico utilizando el software ImageJ y se representó a la derecha.

Las variaciones observadas día a día en el contenido de EV probablemente se deban a efectos diuréticos. Para igualarlos, las muestras pueden normalizarse i) utilizando un factor de corrección de volumen basado en una medición de un parámetro que refleje con precisión EV-, o al menos, la concentración de orina, sin que en sí mismo esté sesgado adicionalmente por ninguna variable fisiológica o patológica, o por ii) utilizar un normalizador interno óptimo para cada categoría de marcadores que sean de nuestro interés. La medición de los parámetros relacionados con los vehículos eléctricos identificados anteriormente se puede utilizar en ambas estrategias. Se pueden utilizar como método de corrección de volumen preanalítico antes del análisis posterior de proteínas o ARN en las preparaciones de EV. También se pueden utilizar en la segunda opción de normalización como marcadores EV internos de "limpieza". Para la medición objetiva de biomarcadores de proteínas, la normalización al nivel de CD9 o Tsg101 es una opción viable, cuya elección se basaría en requisitos metodológicos (por ejemplo, un ELISA versus espectrometría de masas, respectivamente). Discutiremos más a fondo su uso para normalizar los datos de expresión de ARN en el siguiente capítulo (Fig. 9).

Para explorar la primera opción, además de los factores intrínsecos de los EV, también hemos considerado algunos parámetros bioquímicos comunes medidos directamente en la orina como parte de un análisis de laboratorio estándar (Figuras complementarias 2 y 6). Hemos incluido la creatinina porque se utiliza con frecuencia para ajustar los analitos en orina, incluidos los vehículos eléctricos, aunque su precisión para este propósito ha sido debatida durante mucho tiempo. Para identificar indicadores bioquímicos potencialmente útiles, primero evaluamos el grado de asociación entre cada parámetro bioquímico medido en las muestras longitudinales y las mediciones relativas del número de partículas y el contenido de proteínas de los EV (UC) de la orina extraída (Fig. 6). ).

Análisis de parámetros bioquímicos de orina en muestras de orina longitudinales. Las muestras de orina se obtienen a partir de orina obtenida de dos voluntarios sanos, una mujer (marcada como 1) y un hombre (marcado como 2), de 45 y 43 años, en 3 días posteriores. Estas muestras de orina longitudinales se sometieron a un análisis bioquímico de orina de rutina en un laboratorio clínico del Hospital San Raffaele dentro de las dos horas posteriores a su recolección. Los paneles de la derecha muestran el análisis de correlación realizado al trazar los valores de los parámetros bioquímicos seleccionados frente a los parámetros EV medidos de forma independiente en las mismas muestras de orina. Explicación de las siglas utilizadas: CRJ2U, creatinina; ALBU2, albúmina; GLUC3, glucosa; TPU, proteína total en orina; LH2, cadenas ligeras de inmunoglobulina.

De todos los parámetros bioquímicos medidos en muestras de orina originales, el que mejor se correlacionó con el pequeño contenido de EV fue el contenido de proteína total en la orina (TPU) y el nivel de albúmina en la orina. TPU y albúmina se correlacionaron bien con el recuento total de partículas en orina (R = 0,875/0,961), con el contenido de proteína exosomal en orina (R = 0,980/0,907) y con el contenido de CD9 (R = 0,937/0,922) en comparación con la correlación de creatinina que dio coeficientes de 0,670, 0,843 y 0,869 respectivamente. Otros parámetros bioquímicos cuya correlación con el contenido de EV vale la pena considerar es la concentración de glucosa en orina y los niveles de cadenas pesadas de inmunoglobulina (Figura 1 complementaria).

Las correlaciones observadas abrieron una posibilidad interesada de utilizar analitos bioquímicos en orina medidos de forma rutinaria para compensar los efectos de dilución de los diuréticos y corregir/normalizar el contenido general de EV en orina (Fig. 7). Hemos considerado los más prometedores aquellos parámetros de corrección que disminuyeron más la variación entre las muestras de orina longitudinales comparadas. El coeficiente de variación (CV) se calculó dividiendo la desviación estándar relativa y el promedio de todas las muestras. Por ejemplo, la corrección con niveles de TPU en orina redujo el coeficiente de variación entre muestras en términos tanto del número de partículas de orina como del contenido de proteínas de los exosomas de la orina. En cambio, la corrección con creatinina urinaria mostró un efecto de compensación deficiente.

Normalización del contenido de EV a los parámetros bioquímicos de la orina. Los parámetros conservados más indicativos del contenido de EV en orina en muestras de orina longitudinales, a saber, la concentración de partículas en la orina completa, el contenido de proteínas y la señal de CD9 medida en aislados de EV, se normalizaron con parámetros bioquímicos de la orina, como la proteína total en orina (TPU) y la creatinina (CRU). ). El alcance de esta normalización es disminuir la fluctuación de la concentración de EV, indicada aquí por la disminución del coeficiente de variación (CV). Se obtienen muestras de orina de dos voluntarios sanos, una mujer (marcada como 1) y un hombre (marcado como 2), de 45 y 43 años, en 3 días posteriores. Los puntos de muestra se indican en el eje x.

Según los enfoques convencionales para la elaboración y normalización de datos de expresión genética, el análisis del contenido de ARN exosomal puede beneficiarse de algunos normalizadores internos reconocidos que comprenden las especies de ARN que se encuentran expresadas de manera estable en diferentes tejidos humanos y tipos de muestras y que, según se informa, también se clasifican en vesículas. , aunque no son específicos de vesículas. Los ejemplos de estos últimos incluyen ARNm de β-actina o GAPDH, o algunas especies de miARN que incluyen miR-16, miR-191 o miR-243,15,25,26. En el pasado, a menudo se proponían ARN nucleolares pequeños (es decir, SNOU6) para el análisis de la expresión de miARN, mientras que la política emergente es normalizar los datos de qPCR utilizando la misma clase de biomoléculas.27,28 Para hacer frente a la complejidad de los biofluidos, Sería extremadamente beneficioso identificar y utilizar las especies de ARN que están enriquecidas en vesículas de interés, en este caso vesículas similares a exosomas. Además, dependiendo del propósito del estudio, se podría considerar el uso de ARN que puedan normalizarse para vesículas específicas de órganos. Hemos evaluado la expresión de 3 ARNm diferentes en el conjunto de muestras longitudinales, elegidas para representar diferentes categorías de ARN relevantes para posibles estrategias de normalización (Fig. 7). Es de destacar que los ARNm estaban presentes tanto en EV (gránulos de UC) como en fracciones de MV de todas las muestras (Fig. 7), a diferencia del contenido de proteína, que era demasiado bajo y, por lo tanto, no detectable en los gránulos de MV (no se muestra). Se seleccionó la beta-actina como normalizador de la expresión genética de uso común. La transcripción de PSA se sugirió como un potencial ARNm específico de la próstata que puede tener el valor de normalizador o como biomarcador de enfermedad29,30. A menudo se ha informado y evaluado el ARNm de PSA en vehículos eléctricos urinarios. Finalmente, hemos empleado RNY4, un miembro de la familia HY RNA que se ha detectado como especies de ARN abundantes en biofluidos y EV29,31,32.

Todos estos ARNm se detectaron tras la extracción de ARN de vehículos eléctricos, en un material correspondiente a 1 ml de muestra de orina inicial, observándose tendencias aproximadamente similares en todos los puntos experimentales (Fig. 8). La beta-actina y, especialmente el ARNm de PSA, no se expresaron abundantemente en las muestras analizadas. La mala expresión del ARNm de PSA sería coherente con su origen prostático específico y con el hecho de que no utilizamos ningún método de aislamiento que permitiera el enriquecimiento específico de las vesículas derivadas de la próstata. Sin embargo, sorprendentemente, la expresión EV del ARNm de PSA no se correlacionó con el sexo del donante. Se obtuvo una señal más alta para el ARNm de PSA en una muestra de donante femenina (1,1–1,3), lo que genera dudas sobre la utilidad de este ARNm como un marcador verdaderamente específico de la próstata. En cambio, RNY4 se amplificó bien a partir de todos los gránulos de UC. Anteriormente hemos confirmado que este pequeño ARN está enriquecido múltiples veces en vesículas del tamaño de un exosoma con respecto a las células madre (~ ΔCt = 10). Estas dos observaciones constituyen premisas para considerarlo una referencia interna prometedora para el análisis del ARN del EV en orina.

Detección de ARNm de EV en orina mediante RT-qPCR en muestras longitudinales. Después de la ultracentrifugación, se extrajo el ARN total de los sedimentos de EV (UC) y MV y se realizó la amplificación por RT-qPCR de los ARNm de interés como se describe. La purificación se realiza con orina obtenida de dos voluntarios sanos, una mujer (marcada como 1) y un hombre (marcado como 2), de 45 y 43 años, en 3 días posteriores. Para cada muestra se procesaron dos alícuotas de orina de forma independiente y los resultados se presentaron como promedios + DE. Los resultados se muestran como valores de Ct (a la izquierda) y como expresión relativa de ARN (a la derecha) calculada como delta Ct versus muestra de referencia (ARN extraído de exosomas de la línea celular LnCAP de cáncer de próstata).

A primera vista, el patrón absoluto de expresión de ARNm (valores de fila Ct medidos) no reflejaba el número de EV y la concentración de proteína medidos en los mismos gránulos de EV (comparando las Fig. 5 y 8). Por otro lado, transformar los valores de Ct en cantidades (usando el método de Ct comparativo) (Fig. 8C) o convertirlos a una escala lineal (asumiendo una eficiencia de amplificación del 100% para cada ARNm, (2(40-Ct))) revela la patrón que se correlaciona perfectamente con el pequeño contenido general de EV en la orina (como se observa en la Fig. 5). RNY4 se expresó con mayor abundancia en todas las muestras y se correlacionó con el recuento general de partículas en la orina y con el contenido de proteína y CD9 en los EV urinarios con coeficientes de correlación respectivos de R = 0,987, R = 0,0777 y R = 0,837 (Fig. 8). Cabe destacar que la expresión relativa de RNY4 se correlacionó bien con la proteína total en orina, en particular el contenido de albúmina (R = 0,900), en lugar de con los niveles de creatinina (R = 0,585) (Fig. 9). Cuando intentamos corregir las variaciones entre muestras de la expresión de RNY4 normalizándolas con creatinina o proteínas totales en orina33, no observamos la disminución en el CV entre muestras, mientras que la mejor corrección se obtiene considerando los niveles respectivos de CD9 en la muestra. Este último disminuyó la variación general entre muestras a menos del 10% (Fig. 9). Esto respalda el uso de CD9 como marcador EV "de mantenimiento" para corregir las variaciones relacionadas con la dilución de la orina en el contenido de ARN EV.

Normalización de las variaciones del contenido de EV-RNA con respecto a los parámetros bioquímicos de la orina y el número de EV y el contenido de proteínas. Los niveles de expresión de ARN de RV RNY4 en las muestras de orina longitudinales se representaron primero frente a parámetros bioquímicos de orina seleccionados, a saber, creatinina urinaria, albúmina y contenido de proteínas totales, así como frente a indicadores independientes del contenido de EV, como el número de partículas medido en la orina completa y el CD9. señal medida en los respectivos aislamientos EV (a la izquierda). Posteriormente se utilizaron los mismos parámetros en el intento de normalizar/compensar las variaciones en las señales de ARN EV en las muestras, lo que se reveló como una disminución en el coeficiente de variación (CV, a la derecha). Los EV (UC) se purificaron mediante un protocolo basado en (ultra)centrifugación diferencial a partir de orina obtenida de dos voluntarios sanos, una mujer (marcada como 1) y un hombre (marcado como 2), de 45 y 43 años, en 3 días posteriores. Los puntos experimentales se indican en el eje x del panel derecho. Los indicadores que se muestran en el eje y relativo coinciden entre el panel izquierdo y derecho.

En la última parte de nuestro estudio, intentamos desafiar nuestro enfoque para la identificación de los mejores normalizadores de EV aplicándolo a una matriz de miARN personalizada comercial. Hemos elegido la matriz que presenta 24 miARN, incluidos supuestos normalizadores para diversos tejidos y biofluidos, así como supuestos marcadores para diversas enfermedades, incluido el cáncer, que ya hemos implementado para el análisis de la expresión de EV-miARN en muestras de plasma de cáncer (no publicado). ). Hemos evaluado este patrón de expresión de miARN de panel en nuestro pequeño conjunto de muestras longitudinales y hemos identificado dos grupos (Fig. 10). El primero (grupo 1) comprende miARN que se expresan de manera notoria y abundante en diferentes muestras y tejidos humanos (es decir, miR-16, -21, -191, -24). Al evaluar los valores de Ct para el mismo volumen de orina ingresado, estos parecen expresarse de manera uniforme en todas las muestras, independientemente de las variaciones observadas previamente en las concentraciones de EV. En un experimento de control con EV derivados de cultivo LnCAP, notamos que estos miARN no estaban enriquecidos en EV con respecto a un lisado de célula original respectivo (Fig. 10B). Por el contrario, los niveles de un segundo grupo de miARN que abarcan miR-223, -150, -145. -636 y RNU6 (grupo 2) cambiaron en las muestras longitudinales y aparecen enriquecidos en vehículos eléctricos estándar de control con respecto a las celdas respectivas. Los niveles relativos de expresión de miARN se correlacionaron mejor con las fluctuaciones entre muestras observadas en el número de EV y el contenido de proteínas, en particular para los miARN que pertenecen al segundo grupo (Fig. 10A y C). La mejor correlación de la expresión de EV-miRNA se observó con respecto al recuento general de partículas en la orina original (R = 0,967–0,986 para los mRNA que abarcan miR-150, -636, -145 y -223, en comparación con R = 0,368–0,795 para miRNA como como miR-191, -21, -21, -16) y con respecto a los niveles de CD9 en EV urinarios extraídos (R = 0,821–0,904 para el primer grupo y R = 0,644–0,920 para el segundo) (Fig. 10C). En consecuencia, la expresión relativa del grupo de miARN miR-150, -636, -145 y -223 (grupo 2) se asoció bien con el nivel de albúmina en orina (R = 0,886–0,943), pero no con la creatinina en orina (R = 0,533–0,775). ), a diferencia del grupo que comprende miR-191, -21. -21, -16 expresión (grupo 1) que mostró correlación solo semanal con los parámetros bioquímicos de la orina (R = 0,381–0,775 para albúmina y R = 0,568–0,746 para creatinina) (Fig. 10C).

Detección en orina de EV-miRNA mediante RT-qPCR en muestras de orina longitudinales. Después de la ultracentrifugación, se extrajo el ARN total de los sedimentos de EV y MV y se realizó la amplificación y cuantificación por RT-qPCR de un Taqman Custom Array de 24 miARN como se describe. Los resultados se expresan como valores de Ct (B) y como expresión relativa de ARN (Tabla A y panel B a la derecha) calculada como delta Ct versus muestra de referencia (ARN extraído de exosomas de la línea celular LnCAP de cáncer de próstata). El índice de correlación se determinó entre la tendencia observada para los niveles de expresión de miARN en las muestras y los valores respectivos de los parámetros EV seleccionados (concentración de partículas y contenido de proteínas), así como los parámetros bioquímicos medidos en las mismas muestras de orina (creatinina, albúmina y contenido de proteínas totales). ) (C). Finalmente, se intenta la normalización de los niveles de expresión de miARN en puntos longitudinales utilizando los parámetros EV y de orina que mejor se correlacionan (D). Los EV (UC) se purificaron mediante un protocolo basado en (ultra)centrifugación diferencial a partir de orina obtenida de dos voluntarios sanos, una mujer (marcada como 1) y un hombre (marcado como 2), de 45 y 43 años, en 3 días posteriores. Los puntos experimentales se muestran en ejes x relativos. Para cada muestra se procesaron dos alícuotas de orina de forma independiente y se promediaron.

En última instancia, intentamos compensar las variaciones entre muestras de la expresión de miARN en preparaciones de EV normalizando los resultados mediante parámetros de EV, obteniendo los mejores resultados cuando se utilizó el recuento de partículas medido en la orina pura y el contenido de CD9 en la orina (Fig. 10D). ). Este resultado fue coherente con los resultados descritos anteriormente.

En general, este enfoque señalaría al grupo 2 como un panel de miARN atractivo para una mayor validación como calibrador del contenido de miARN EV en orina en la cohorte de muestra extendida.

Queríamos comparar nuestro enfoque y resultados con un método ampliamente utilizado y reconocido para la identificación de controles internos confiables para la normalización de datos de expresión génica/miARN. Este método consiste en el uso de algoritmos estadísticos que clasifican los genes de referencia calculando su estabilidad de expresión global, en asociación con otros posibles genes de control. De hecho, aplicamos tres de las soluciones de software más utilizadas y frecuentemente combinadas, a saber, GeNorm, NormFinder y BestKeeper (Fig. 3A-C complementaria) a los datos de entrada que comprenden datos de expresión relativa (cantidades) o de expresión absoluta (valores Ct) recopilados de nuestro conjunto de muestra piloto, de acuerdo con los requisitos de cada algoritmo34. La suposición clave de todos estos algoritmos es que los genes de referencia candidatos investigados no varían en su expresión sistemáticamente entre las muestras que se consideran. Aunque esto es cierto en términos del impacto de diferentes condiciones fisiológicas o patológicas, en el caso de la identificación y aplicación de biomarcadores de vesículas urinarias, esta suposición se ve violada en la práctica por las fluctuaciones diarias en la dilución de diuréticos en la orina. Si seguimos el escenario aplicado en este estudio, que presenta el uso de los mismos volúmenes de entrada de muestras, sin normalizar la entrada de ADNc para RT-PCR, entonces el uso de algoritmos computacionales es innatamente defectuoso. La medición del ARN/ADNc extraído de vehículos eléctricos aislados de volúmenes bajos de orina original (1 ml) es difícil e imprecisa incluso con el uso de ensayos Qubit, y requiere mucho tiempo y es costoso para análisis de rutina o de alto rendimiento. De hecho, los tres algoritmos empleados para analizar los datos de expresión de miARN en un conjunto piloto de muestras longitudinales (6 puntos experimentales, 12 muestras procesadas de forma independiente) indicarían que los genes más estables son miR-24 y miR-16 que aparentemente son estables en todas las muestras. sin verse afectados por las diferencias reales en la concentración de vehículos eléctricos. Este enfoque tiene una clara limitación para la selección de referencias internas confiables en este caso, donde la falta de efecto estadístico no tiene en cuenta la variación específica de la muestra y, por lo tanto, no aborda el problema específico abordado por este estudio.

El presente estudio aborda algunas cuestiones fundamentales, aún no resueltas, en el análisis de los vehículos eléctricos urinarios y su contenido asociado, en particular los ARN, con respecto al sesgo debido a variables preanalíticas y estrategias de normalización inapropiadas. Si bien resolver estos acuerdos traería beneficios para la investigación, el descubrimiento de biomarcadores y el desarrollo de diagnósticos, tendemos a privilegiar las soluciones que probablemente ofrezcan un mayor cumplimiento de las prácticas actuales de laboratorio clínico en términos de sincronización y procesamiento de muestras de orina. Al mismo tiempo, también se abordan los protocolos que facilitarían el manejo de muestras para su almacenamiento y transporte, así como para atender las necesidades de biobancos y estudios multicéntricos. Para esta perspectiva, en este estudio nos centramos en muestras de orina "aleatorias" en lugar de la recolección de orina de 24 h, ya que las primeras son una práctica común en consultas clínicas y biobancos, y se propone que se correlacionen bien con la orina de 24 h en cuanto a sus tasas de excreción de proteínas16.

En la investigación de vehículos eléctricos, las variaciones preanalíticas se ven exacerbadas por el hecho de que el campo es relativamente nuevo y todavía existe una dependencia de protocolos "específicos de laboratorio" y una falta general de consenso. Esto afecta en particular a los estudios colaborativos multicéntricos y al uso de muestras de biobancos para la validación de marcadores de vehículos eléctricos. Si bien las variaciones biológicas intrínsecas y extrínsecas entre muestras (es decir, edad, sexo, ritmo circadiano, índice de masa corporal, medicación, enfermedad actual, etc.) deben considerarse cuidadosamente al interpretar los datos, es necesario controlar y controlar las variaciones técnicas introducidas durante la recolección o el procesamiento. ojalá excluido. La estabilidad de vehículos eléctricos pequeños, una vez purificados, incluidos los exosomas, almacenados congelados durante períodos prolongados ya está bien documentada35. Sin embargo, el almacenamiento de orina después de la recolección inicial y antes del aislamiento y análisis de exosomas/VE puede seguir siendo un desafío en los entornos de análisis clínicos de rutina, y aún más en el caso de que se requiera el envío de muestras en el marco de un gran descubrimiento de biomarcadores. esfuerzos. Para inhibir la degradación y preservar la estabilidad de analitos de orina que de otro modo serían inestables, la práctica clínica habitual prevé que todas las muestras de orina, a menos que se analicen dentro de las 2 h, se refrigeren durante la recolección y se mantengan congeladas hasta el análisis necesario. Además, rara vez se aplican diferentes conservantes y estabilizantes, incluidos ácidos, bases, formaldehído, tolueno, biocidas o inhibidores de proteínas36. Muchos estudios, junto con nuestras observaciones, demostraron que el almacenamiento de orina a -20 °C, que corresponde al almacenamiento estándar de muestras clínicas a corto plazo, parece menos favorable para la recuperación de EV, debido a una alta tasa de degradación y al pronunciado precipitado de fosfato de calcio que se forma en este punto. temperatura específica2. De hecho, el consenso común es que el almacenamiento entre -70 y -80 °C debería ser óptimo. El hecho es que el almacenamiento de grandes volúmenes y el envío de muestras congeladas para el análisis de vehículos eléctricos puede resultar costoso y poco fiable, lo que posiblemente altere su estabilidad. La congelación de muestras puede causar potencialmente la pérdida de vehículos eléctricos, ya sea debido a una mayor agregación de vesículas o a su adsorción en la superficie del recipiente de recolección. La ventaja adicional de evitar la congelación de la orina, al igual que otros biofluidos, es la conservación de microvesículas más grandes que normalmente se pierden durante los ciclos de congelación y descongelación.

Informamos la estabilidad de los EV urinarios y su contenido tras la conservación a temperatura ambiente después de 6 meses, así como la recuperación y el análisis de los marcadores EV de 1 ml de volumen de orina original. La elección de una técnica de aislamiento de vehículos eléctricos específica depende del tipo de usos posteriores. Empleamos tres protocolos desplegables de EV de un solo paso, todos los cuales recuperaron EV cuantificables y marcadores asociados. Observamos diferencias en el rendimiento y en las proporciones relativas de diferentes parámetros EV medidos, de manera consistente con lo informado en otros estudios. Al detectar marcadores ya asociados a EV en muestras de pacientes de bajo volumen, es posible priorizar el rendimiento (como CP) o el enriquecimiento seleccionado de EV de interés (IA), así como elegir soluciones simples y que requieren poco tiempo (ofrecidas por ambos). Tomamos en consideración que puede ocurrir una pérdida selectiva de algunos marcadores particulares, como algunas especies de miARN, dependiendo de diferentes protocolos de aislamiento y debido a su diferente impacto en diferentes subpoblaciones de vesículas en la orina3,15. Se ha informado sobre la clasificación preferencial de distintos miARN en poblaciones de vesículas específicas, distintas por tamaño o inmunofenotipo26. En estas evaluaciones piloto utilizamos ARN expresados ​​de forma ubicua que no se limitan a las vesículas, aunque la evidencia respalda un perfil general de miARN más sólido a partir de la fracción vesicular de la orina en lugar de directamente de la orina completa25. Esto significa que, aunque es probable que los EV contengan la mayoría de los ARN urinarios, el análisis de las preparaciones utilizadas en la presente, como los gránulos de UC o CP que también contienen contaminantes coprecipitados, no reflejan solo el contenido intra-EV. En este sentido, algunos estudios sugieren que el ARN extravesicular en la orina no se recupera junto con los VE precipitados, lo que concuerda con la alta presencia de ribonucleasas en la orina después de la CU37.

En este estudio, procedimos con la UC ya que equilibra una subpoblación de vehículos eléctricos sin sesgo versus una subpoblación de vehículos eléctricos específica, con una amplia adopción de este método de aislamiento de vehículos eléctricos para la cuantificación de una variedad de indicadores de vehículos eléctricos comunes. Finalmente, abordamos la idoneidad de diferentes estrategias de normalización aplicadas en la fase preanalítica o analítica del análisis cuantitativo de ARNm y miARN de EV. Dicha normalización es un desafío debido a la enorme variación de los diuréticos en orina entre donantes y dentro de ellos en los puntos de recolección longitudinales, así como a la heterogeneidad intrínseca de los EV. Las decisiones de normalización preanalíticas y durante el análisis también pueden conducir a una generación de datos sesgados y enmascarar el reconocimiento de biomarcadores de vehículos eléctricos raros y relevantes. Está claro que los requisitos para el análisis de expresión en EV en orina pueden no coincidir con las recomendaciones respectivas para los ARN derivados de células y tejidos, e incluso pueden diferir de los de otros EV de biofluidos.

En nuestra opinión, la normalización preanalítica basada en el uso de uno de los parámetros bioquímicos de la orina medidos rutinariamente sería atractiva para hacer frente a las variaciones de la concentración de la orina y permitiría el debido ajuste de los volúmenes de muestra o de las cantidades medidas. Este último modo cumpliría con la forma en que se realiza el diagnóstico clínico hoy en día, que es volumétrico: normalmente se miden ciertos volúmenes de muestras de biofluido y los resultados se comparan con valores de referencia. Hasta la fecha muchos estudios han propuesto o cuestionado el uso de creatinina para tales fines. De hecho, los niveles de creatinina no son simplemente atribuibles a simples variaciones en la dilución de la orina sino más bien a la función renal y, por lo tanto, pueden introducir un sesgo en las comparaciones interpoblacionales o incluso longitudinales. Esto podría ser particularmente evidente en condiciones patológicas y podría pasar desapercibido en las comparaciones de individuos sanos. En cambio, hemos propuesto otros parámetros, como el contenido total de proteínas en la orina o la albúmina, que, a diferencia de la creatinina, se correlacionan muy bien con los indicadores independientes de la concentración de EV en la orina, es decir, el número de partículas o el contenido de proteínas EV. El contenido de sales o glucosa también merece una mayor consideración, junto con la conductividad y la gravedad de la orina probablemente interrelacionadas, que son, además de la creatinina, los sustitutos de la concentración de orina más utilizados. Sin embargo, también la proteinuria urinaria o los niveles de albúmina podrían verse influenciados por una condición patológica particular. Debemos tener en cuenta que ni las partículas similares a exosomas medidas por NTA ni el contenido de proteínas del sedimento de UC son puramente atribuibles a los vehículos eléctricos debido a los artefactos y los contaminantes co-peleados, respectivamente. Esta maniobra de corrección debería probarse en una cohorte de muestras ampliada y posiblemente acoplarse a biomarcadores EV específicos de la condición. Realizamos un estudio exploratorio en el que analizamos una gran cantidad de parámetros en un pequeño conjunto de muestras de donantes sanos y detectamos variaciones consistentes intra e intermuestras que nos llevaron a seleccionar aquellos que son más prometedores para la normalización de la concentración de EV. De tal manera, este enfoque, si bien tiene un atractivo obvio y coincide con la práctica clínica estándar bien establecida, será factible para su validación en cohortes de muestras ampliadas y específicas, implementando POE optimizados para la conservación de muestras de orina.

El uso de controles internos, los llamados genes "de limpieza", es la estrategia más reconocida para la normalización analítica del análisis de la expresión génica. Sin embargo, demostramos que la aplicación de estrategias desarrolladas y utilizadas comúnmente para muestras de tejido puede ser engañosa para la identificación de los paneles normalizadores adecuados para el análisis de ARN EV en biofluidos complejos. Esto es particularmente cierto en el caso de la orina que, a diferencia de la sangre, “no está amortiguada” para las variaciones de volumen, concentración y pH. Por lo tanto, consideramos que los mejores normalizadores de miARN de EV son aquellos miARN cuya tendencia evaluada longitudinalmente imitaba muy bien los cambios de concentración de EV medidos de forma independiente en las mismas muestras. Hemos identificado un panel normalizador potencial que comprende miARN con abundancia diferente y, por lo tanto, adecuado para diferentes objetivos de interés. No consideramos que este panel sea una solución universal, sino que proponemos un enfoque de este tipo para evaluar y definir los paneles normalizadores que se adaptan a una investigación o pregunta clínica específica.

Existe cierta evidencia que respalda el modelo de baja abundancia y baja ocupación de clasificación de miARN en vehículos eléctricos pequeños38. Esto significa que solo un subconjunto de microARN celulares se empaqueta en EV similares a exosomas, y se informa que el contenido, en términos de copias por vesícula, es bajo (mucho menos de 1) incluso para miARN abundantes como miR 223. Por otro lado, se ha demostrado que la clasificación de ciertos miARN en vehículos eléctricos es específica39, ya sea dependiente de la fuente de vehículos eléctricos o limitada a algunas subpoblaciones de vehículos eléctricos26. Por ejemplo, los miARN pueden coclasificarse con tetraspaninas específicas. Esto encajaría muy bien con la fuerte correlación observada con el contenido de miARN y la expresión de CD9 en los vehículos eléctricos urinarios, y puede proporcionar algunas implicaciones para el desarrollo de estrategias de aislamiento de vehículos eléctricos destinadas al enriquecimiento específico de subpoblaciones de vehículos eléctricos particulares y biomarcadores de vehículos eléctricos particulares.

Nuestros datos indican que RNY4 es un buen candidato como parte de un panel de referencia interno para el análisis de ARN de EV en orina. Este ARN se transcribe mediante la ARN polimerasa III, mientras que los genes codificantes de proteínas se transcriben mediante la ARN polimerasa II. Sin embargo, el transcriptoma RNA Pol III muestra una complementariedad de secuencia significativa con los genes codificadores de proteínas y se sugiere que interactúa y regula su metabolismo y expresión40. Este pequeño ARN podría ser un control adecuado para la evaluación de la expresión del ARNm y justificar más estudios de confirmación. Un aspecto que debe determinarse empíricamente para cada candidato a normalizador es la eventual variación patológica. Por ejemplo, se informa que los ARN HY tienen una regulación positiva múltiple en algunos cánceres o enfermedades inflamatorias41. La evidencia también sugiere que parte del procesamiento de los ARN HY se produce en los mismos vehículos eléctricos que los transportan42.

Cabe destacar que el contenido de EV de CD9 es una buena opción para mediciones inmunométricas que pueden integrarse fácilmente con el análisis de otros marcadores de EV (no solo proteínas) en la orina, mientras que Tsg101 sigue siendo un candidato atractivo para la normalización de muestras en la fase de descubrimiento de biomarcadores en espectrometría de masas y estudios metabolómicos. La estabilidad de la expresión de estos marcadores exosomales en las muestras podría verse cuestionada en condiciones patológicas específicas como el cáncer y los estados inflamatorios y, por lo tanto, debe considerarse cuidadosamente en estudios de biomarcadores específicos. Además, se debe determinar la clasificación conjunta de cualquier marcador particular de interés para las vesículas positivas para CD9 o TSG101, debido a la heterogeneidad en las rutas de biogénesis y los inmunofenotipos de los EV.

Los fluidos corporales son una fuente inagotable de biomarcadores útiles para el diagnóstico y pronóstico de muchas enfermedades, incluido el cáncer. La orina en particular, debido a su facilidad de recolección, su contenido menos complejo con respecto a la sangre y que refleja principalmente la contribución del tracto urinario, garantiza el cumplimiento del paciente y el seguimiento longitudinal de la enfermedad. Por otro lado, las fluctuaciones diuréticas y los numerosos factores que pueden afectar a su volumen y contenido, dificultan la interpretación de los resultados de los análisis de orina. Por esta razón, las decisiones preanalíticas y postanalíticas con respecto al procesamiento y normalización del contenido de orina son un paso clave en la identificación de biomarcadores y su traducción a la práctica clínica. Dado que los vehículos eléctricos han sido considerados un sustituto de las células que los producen y centinelas en tiempo real de la homeostasis de los tejidos, la plena realización de su potencial de biomarcadores depende fundamentalmente de una comprensión correcta y una solución de tales problemas.

En general, nuestro estudio impulsa estrategias tanto preanalíticas como analíticas que cumplen mejor con los procedimientos clínicos establecidos, sin incluir un manejo extenso de muestras ni una laboriosa purificación o recuento de vehículos eléctricos antes del análisis. Este diseño de estudio exploratorio (procesamiento de muestras independiente para réplicas biológicas y evaluación de una gran cantidad de parámetros en un pequeño conjunto de muestras de probandos) permitió una evaluación piloto de las variaciones longitudinales de los parámetros bioquímicos y EV en la orina, lo que proporcionó candidatos para la validación de biomarcadores EV en orina específicos. estudios (pequeño número de parámetros en cohortes de muestra grandes).

Todos los datos que respaldan las conclusiones de este artículo de investigación se incluyen en el manuscrito.

vesículas extracelulares

Análisis de seguimiento de nanopartículas.

Microvesículas

Temperatura ambiente

Ultracentrifugación

Menú desplegable basado en inmunoafinidad

Precipitación química

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Este trabajo fue apoyado por Regione Lombardia y Fondazione Cariplo (proyecto HYDROGEX, subvención n° 2018-1720) y por el programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea (proyecto MARVEL, subvención n° 951768) para RV y Nueva Zelanda.

Instituto de Investigaciones Urológicas, División de Oncología Experimental, Instituto Científico IRCCS San Raffaele, Milán, Italia

Ricardo Vago

Universidad Vita-Salute San Raffaele, 20132, Milán, Italia

Ricardo Vago

Exosomics SpA, 53100, Siena, Italia

Giorgia Radano, Davide Zocco y Natasa Zarovni

HansaBiomed Life Sciences OU, Tallin, Estonia

Natasa Zarovni

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Conceptualización, RV y NZ; procesamiento y metodología de muestras, RV, GRDZ y NZ; análisis de datos, RV, DZ y NZ; redacción del borrador original, Nueva Zelanda; redacción, revisión y edición, RV y Nueva Zelanda; supervisión, RV y NZ Todos los autores han leído y aceptado la versión publicada del manuscrito; adquisición de financiación RV y Nueva Zelanda

Correspondencia a Riccardo Vago o Natasa Zarovni.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Vago, R., Radano, G., Zocco, D. et al. Las estrategias de estabilización y normalización de la orina favorecen el análisis imparcial del contenido de EV en la orina. Informe científico 12, 17663 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-22577-3

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Recibido: 25 de febrero de 2022

Aceptado: 17 de octubre de 2022

Publicado: 21 de octubre de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-22577-3

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